COSY vs. TOCSY: Die wichtigsten Unterschiede verstehen und Spektren interpretieren

Für die Strukturanalyse komplexer organischer Moleküle und Naturstoffe 2D-homonukleare skalare Korrelations-NMR-Experimente gehören zu den nützlichsten Werkzeugen zur Auflösung von Mehrdeutigkeiten, die durch überlappende Signale in 1D-Spektren verursacht werden.

Zu den am weitesten verbreiteten ¹H-¹H-Korrelationsexperimenten,beantworten COSY und TOCSY zwei verschiedene, aber komplementäre Fragen.

COSY wird hauptsächlich verwendet, um lokale Proton-zu-Proton-Konnektivität durch beobachtbare J-Kopplungen zu verfolgen, während TOCSY den Magnetisierungstransfer über ein kontinuierliches Kopplungsnetzwerk erweitert und dabei hilft, alle beobachtbaren Mitglieder desselben Spinsystems zu identifizieren.

Praktisch gesehen hilft COSY bei der Beantwortung der Frage „Welche Protonen sind miteinander gekoppelt?“, während TOCSY bei der Beantwortung der Frage hilft „Welche Protonen gehören zum selben Spinsystem?“

Dieser Artikel führt durch die beiden Experimente, von den Prinzipien der Pulssequenz bis zur praktischen Interpretation der Spektren, und erläutert ihre wesentlichen Unterschiede sowie deren gemeinsame Anwendung in der 2D-NMR-Spektroskopie.

1. Kernfunktionen von COSY und TOCSY

COSY, oder Correlation Spectroscopy, und TOCSY, oder Total Correlation Spectroscopy, nutzen beide skalare Kopplung, oder J-Kopplung, um Protonenkorrelationsinformationen durch chemische Bindungen bereitzustellen.

Die Art der strukturellen Informationen, die sie aufdecken sollen, ist jedoch unterschiedlich.

Betrachten Sie eine kontinuierlich gekoppelte Protonenkette:

H1 → H2 → H3 → H4

COSY: Lokale Kopplungskonnektivität

COSY detektiert primär direkt beobachtbare skalare Kopplungen zwischen Protonenpaaren.

Die häufigsten Korrelationen entstehen durch ²J_HH und ³J_HH-Kopplungen, zum Beispiel:

H1 ↔ H2
H2 ↔ H3
H3 ↔ H4

Diese paarweisen Korrelationen ermöglichen es Forschern, die lokale Protonenkonnektivität Schritt für Schritt aufzubauen.

Mit anderen Worten, ein COSY-Spektrum ist besonders nützlich, wenn das Ziel darin besteht, die sequentielle Beziehung zwischen benachbarten oder anderweitig nachweisbar gekoppelten Protonen zu rekonstruieren.

Hinweis: COSY-Korrelationen sind nicht auf Zwei-Bindungs- und Drei-Bindungs-Kopplungen beschränkt. In allylischen Systemen, aromatischen Systemen oder starren W-Geometrien kann eine ausreichend starke ⁴J-Kopplung, typischerweise größer als etwa 1,5 Hz, ebenfalls einen COSY-Kreuzpeak erzeugen. Daher sollte das Vorhandensein eines Kreuzpeaks allein nicht als Beweis dafür angesehen werden, dass zwei Kerne in der Molekülstruktur direkt benachbart sind.

TOCSY: Zuordnung eines gesamten Spinsystems

TOCSY verfolgt einen anderen Ansatz.

Durch Magnetisierungstransfer über ein J-gekoppeltes Netzwerk können Protonen innerhalb desselben kontinuierlichen Spinsystems korreliert werden, selbst wenn zwei bestimmte Protonen keine starke direkte Kopplung zueinander aufweisen.

Sein Hauptzweck besteht daher nicht darin, die direkte Konnektivität jedes Protonenpaars zu bestimmen. Stattdessen wird TOCSY verwendet, um mehrere Protonen zu identifizieren und zu gruppieren, die zum selben Spinsystem gehören.

Wenn beispielsweise H1, H2, H3 und H4 ein kontinuierliches Kopplungsnetzwerk bilden, kann sich die Magnetisierung durch die Sequenz ausbreiten:

H1 → H2 → H3 → H4

Als Ergebnis können Korrelationen zwischen weiter entfernten Mitgliedern des Systems im TOCSY-Spektrum erscheinen.

Hinweis: Ein Spinsystem besteht normalerweise aus einer Gruppe von Kernen, die durch einen kontinuierlichen Pfad ausreichend starker J-Kopplungen verbunden sind. Wenn die effektive Kopplung zwischen Teilen eines Moleküls sehr schwach wird oder fehlt, kann der Magnetisierungstransfer unterbrochen werden. Dies kann auftreten, wenn Gruppen durch ein quartäres Kohlenstoffatom, bestimmte Heteroatom-Anordnungen oder Geometrien mit einem Diederwinkel nahe 90° getrennt sind, bei denen die Kopplung sehr klein wird. Das Ergebnis ist die Bildung relativ unabhängiger Spinsysteme.

2. Prinzipien der Pulssequenz

Der grundlegende Unterschied zwischen COSY und TOCSY ergibt sich aus der Art und Weise, wie der Magnetisierungstransfer nach der indirekten Evolutionsperiode, t₁, gehandhabt wird.

2.1 COSY

Die grundlegende COSY-Pulssequenz kann wie folgt dargestellt werden:

90° - t₁ - 90° - Akquisition (t₂)

Der erste 90°-Puls rotiert die longitudinale Magnetisierung in die Transversalebene.

Während der t₁-Evolutionsperiode tragen sowohl die chemische Verschiebung als auch die J-Kopplung zur Entwicklung der Kohärenz bei.

Der zweite 90°-Puls erzeugt dann einen direkten Kohärenztransfer.

Kohärenz, die auf dem ursprünglichen Kern verbleibt, trägt während der t₂-Akquisitionsperiode zum diagonalen Signal bei, während auf einen gekoppelten Kern übertragene Kohärenz einen Kreuzpeak erzeugt.

Konventionelle COSY zeichnet daher hauptsächlich paarweise direkte J-Kopplungsbeziehungen auf.

Im Spektrum repräsentieren diese Korrelationen üblicherweise benachbarte Protonen oder geminale Protonen, die an denselben Kohlenstoff gebunden sind.

2.2 TOCSY

TOCSY führt eine zusätzliche Spin-Lock-Mischperiode nach der t₁-Evolutionsperiode ein.

Der Spin-Lock ist nicht einfach ein langer HF-Puls. Er wird üblicherweise unter Verwendung von zusammengesetzten Pulsfolgen wie MLEV-17 oder DIPSI-2 implementiert.

Während der Mischzeit erzeugen diese zusammengesetzten Pulse eine isotrope Mischung, die es der Magnetisierung ermöglicht, sich durch ein kontinuierliches J-Kopplungsnetzwerk auszubreiten.

Die Magnetisierung überträgt sich zuerst zwischen direkt gekoppelten benachbarten Protonen und kann dann schrittweise durch das System fortfahren:

H1 → H2 → H3 → H4

Dieser Relay-Mechanismus ermöglicht es TOCSY, entferntere Mitglieder desselben Spinsystems zu korrelieren.

Mischzeit in TOCSY

Die Dauer der Spin-Lock-Periode wird als Mischzeit bezeichnet und ist einer der wichtigsten Parameter, die die Tiefe des Magnetisierungstransfers in TOCSY steuern.

Kurze Mischzeit, zum Beispiel 20 bis 30 ms

Die Magnetisierungstransfer hat gerade erst begonnen. Korrelationen werden von nahegelegenen gekoppelten Protonen dominiert, sodass das resultierende Spektrum einem COSY-Spektrum ähneln kann.

Mäßig lange Mischzeit, zum Beispiel 60 bis 100 ms

Dies ist ein allgemein nützlicher Bereich für viele kleine Moleküle und Naturstoffe. Die Magnetisierung hat mehr Zeit, sich durch ein kontinuierliches Spinsystem auszubreiten, wodurch entferntere Mitglieder korreliert werden können.

Längere Mischzeiten

Länger ist nicht immer besser.

Eine Erhöhung der Mischzeit kann es der Magnetisierung ermöglichen, entferntere Teile des Kopplungsnetzwerks zu erreichen, aber Relaxations- und HF-bezogene Effekte werden ebenfalls zunehmend wichtig.

T₂-Relaxation kann die Signalintensität verringern, während HF-Erwärmung und andere experimentelle Effekte zum Signalverlust oder zur Linienverbreiterung beitragen können. Unter bestimmten Pulssequenz- und experimentellen Bedingungen können längere Mischperioden auch unerwünschte Relaxationseffekte oder pulsbedingte Artefakte verstärken.

Aus diesem Grund sollte die optimale TOCSY-Mischzeit entsprechend der Molekülgröße, der Kopplungstopologie, dem Relaxationsverhalten und dem interessierenden Spinsystem ausgewählt werden.

3. Wie man COSY- und TOCSY-Spektren interpretiert

In einem 2D-¹H-¹H-Spektrum repräsentieren beide Achsen die chemischen Verschiebungen der Protonen.

Signale entlang der Diagonale entsprechen Resonanzen, die im konventionellen 1D-¹H-NMR-Spektrum beobachtet werden.

Kreuzsignale, die sich abseits der Diagonale befinden, zeigen an, dass Magnetisierung zwischen zwei Protonenresonanzen durch skalare Kopplungspfade übertragen wurde.

Je nach Experiment können diese Korrelationen entweder direkte paarweise Kopplungen oder Konnektivitäten innerhalb eines kontinuierlichen Spinsystems darstellen.

Das folgende Beispiel verwendet n-Butylacetat zur Veranschaulichung der praktischen Interpretation von COSY- und TOCSY-Spektren.

3.1 COSY: Schrittweiser Aufbau der Protonensequenz

In n-Butylacetat besitzt das Carbonyl-Kohlenstoffatom kein gebundenes Proton.

Es gibt zudem keinen beobachtbaren kontinuierlichen Protonenkopplungspfad zwischen der Acetyl-Methylgruppe und der n-Butylkette.

Die n-Butylkette kann daher mithilfe einer schrittweisen Nachverfolgungsstrategie analysiert werden.

• Beginnen Sie mit dem isoliertesten tieffeldigen Protonensignal, H2 bei etwa 4,0 ppm.
• Folgen Sie der horizontalen Linie von H2, bis das H2 ↔ H3-Kreuzsignal bei etwa 1,6 ppm gefunden wird.
• Kehren Sie als Nächstes zum H3-Diagonalsignal zurück und suchen Sie nach dessen nächster benachbarter Korrelation. Dies offenbart die H3 ↔ H4 Kreuzpeak bei etwa 1.4 ppm.
• Fahren Sie von H4 aus mit demselben Prozess fort, um die H4 ↔ H5 Korrelation bei etwa 0.9 ppm zu identifizieren.

Durch das Verfolgen dieser einzelnen paarweisen Kreuzpeaks kann die lokale Protonen-Konnektivitätssequenz Schritt für Schritt rekonstruiert werden.

Wichtig ist, dass es im COSY-Spektrum keine wesentlichen H2 ↔ H4 oder H2 ↔ H5 Korrelationen gibt.

Dies verdeutlicht einen der wichtigsten Unterschiede zwischen COSY und TOCSY. COSY zeigt primär die beobachtbaren paarweisen Kopplungsbeziehungen, die für den Aufbau des lokalen Protonengerüsts erforderlich sind.

3.2 TOCSY: Verwendung eines Ankersignals zur Identifizierung des gesamten Spinsystems

Für ein TOCSY-Spektrum, das mit einer geeigneten Mischzeit aufgenommen wurde, kann eine andere Interpretationsstrategie verwendet werden.

• Wählen Sie zunächst eine isolierte Protonenresonanz als Ankersignal aus. In diesem Beispiel ist H2 bei etwa 4.0 ppm ein praktischer Anker, da es gut von den anderen Protonensignalen getrennt ist.
• Ziehen Sie als Nächstes eine horizontale Linie bei der chemischen Verschiebung von H2.
• Entlang dieser Linie erscheint der H2-Diagonalpeak zusammen mit Kreuzpeaks, die H2 mit H3, H4 und H5 korrelieren.
• Im Gegensatz dazu erscheint das Acetyl-Methyl-Proton H1 nicht entlang dieser Spur.

Diese Signale können daher demselben n-Butyl-Spinsystem zugeordnet werden.

Das Fehlen von H1 in dieser Spur zeigt an, dass die Acetyl-Methylgruppe und die n-Butyl-Protonen unter diesen Bedingungen zu unterschiedlichen Spinsystemen gehören.

Dieser Ansatz ist besonders nützlich für komplexere Moleküle.

Bei Peptiden kann beispielsweise ein Amid-NH- oder ein α-H-Signal als Anker verwendet werden. Bei Oligosacchariden ist das anomere Proton H-1 oft ein besonders nützliches Ankersignal.

In diesen Systemen können viele intermediäre Protonenresonanzen innerhalb eines engen Bereichs der chemischen Verschiebung überlappen. Eine schrittweise COSY-Zuordnung kann daher schwierig werden oder durch starke spektrale Überlappung unterbrochen werden. TOCSY kann helfen, dieses Problem zu umgehen, indem es ermöglicht, dass sich Korrelationen über das gekoppelte Netzwerk erstrecken, wodurch es möglich wird, Signale in Spinsysteme zu klassifizieren, selbst wenn einzelne intermediäre Resonanzen schwer zu unterscheiden sind.

4. COSY vs. TOCSY: Die wichtigsten Unterschiede auf einen Blick

COSY und TOCSY sind daher keine konkurrierenden Experimente.

Sie liefern unterschiedliche Ebenen struktureller Informationen und sind oft am nützlichsten, wenn sie zusammen interpretiert werden.

5. Häufig gestellte Fragen

1. Ist eine längere TOCSY-Mischzeit immer besser?

Nein.

Für konventionelle kleine Moleküle ist 60 bis 100 ms oft ein vernünftiger Bereich für erste Tests.

Für komplexere Proben kann es nützlich sein, zwei Datensätze zum Vergleich aufzunehmen, zum Beispiel eine kurze Mischzeit von 20 bis 30 ms und eine relativ lange Mischzeit von 80 bis 100 ms.

Bei einer kurzen Mischperiode wird das Spektrum von Korrelationen zwischen benachbarten Protonen dominiert. Eine längere Mischperiode kann entferntere Korrelationen innerhalb desselben Spinsystems aufdecken.

Der optimale Wert hängt jedoch von mehreren experimentellen Faktoren ab, einschließlich J-Kopplung, Relaxationsverhalten, Lösungsmittel, Temperatur, Sondenleistung und HF-Leistung. Die Mischzeit sollte daher für die spezifische Probe und das experimentelle Ziel optimiert und nicht einfach maximiert werden.

2. Wenn kein Kreuzpeak beobachtet wird, können wir daraus schließen, dass zwei Protonen nicht benachbart oder verwandt sind?

Nein.

Das Fehlen eines sichtbaren Kreuzpeaks bedeutet nicht zwangsläufig, dass zwei Kerne nicht verwandt sind.

Zum Beispiel kann gemäß der Karplus-Beziehung, bestimmte Diederwinkel ³J-Kopplung signifikant reduzieren.

Ein Kreuzpeak kann auch schwer zu beobachten sein, wenn er nahe an der Diagonale liegt und von diagonalen Ausläufern verdeckt wird.

Austauschbare Protonen können einem schnellen chemischen Austausch unterliegen, was zu einer signifikanten Linienverbreiterung führt.

In TOCSY kann eine zu kurze Mischzeit auch verhindern, dass die Magnetisierung entferntere Mitglieder des Spinsystems erreicht.

Daher sollte eine Schlussfolgerung auf „keine Kopplung“ nicht allein auf einem fehlenden Kreuzpeak basieren. Die Interpretation sollte auch 1D-Aufspaltungsmuster, komplementäre 2D-NMR-Daten und die für das Experiment verwendeten Akquisitionsparameter berücksichtigen.

3. Was sind die Vorteile von gradientenverstärkten Experimenten wie gCOSY und gTOCSY?

Gepulste Feldgradienten, oder PFGs, können verwendet werden, um spezifische Kohärenztransferpfade auszuwählen und einige t₁-Rauschen und Artefakte zu unterdrücken.

Im Vergleich zu bestimmten konventionellen phasenzyklischen Experimenten können gradientenverstärkte Sequenzen auch die Anzahl der erforderlichen Scans reduzieren.

Die tatsächlich eingesparte Gerätezeit hängt von der jeweiligen Pulssequenz und den Akquisitionsparametern ab.

Die Gradientenselektion kann jedoch grundlegende experimentelle Probleme nicht kompensieren. Schlechte Shim-Einstellungen, ungenaue Pulskalibrierung, unzureichende Lösungsmittelunterdrückung oder unzureichende Abtastung in der indirekten Dimension können die spektrale Qualität weiterhin beeinträchtigen. Ein guter grundlegender experimenteller Aufbau bleibt für den Erhalt zuverlässiger COSY- und TOCSY-Spektren.

Die Wahl zwischen COSY und TOCSY in der Praxis

COSY und TOCSY bilden eine der nützlichsten Kombinationen in der 2D-NMR-Spektroskopie.

COSY hilft dabei festzustellen, welche Protonen direkt beobachtbare J-Kopplungsbeziehungen zeigen, was es besonders nützlich für die Rückverfolgung lokaler Konnektivität macht.

TOCSY hilft zu bestimmen, welche Protonen zum selben Spinsystem gehören, was es Forschern ermöglicht, verwandte Resonanzen zu gruppieren, selbst wenn einzelne Zwischenpeaks überlappen oder entfernte Protonen keine starke direkte Korrelation zeigen.

Der Schlüssel liegt darin, die strukturelle Fragestellung zu definieren, bevor das Experiment ausgewählt wird.

Wenn das Ziel darin besteht, eine lokale Protonensequenz zurückzuverfolgen, ist COSY oft der natürliche Ausgangspunkt. Wenn das Ziel darin besteht, die Mitglieder eines gesamten gekoppelten Spinsystems zu identifizieren, kann TOCSY die benötigten zusätzlichen Informationen liefern.

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Bei der Interpretation von COSY- oder TOCSY-Spektren ist der schwierigste Teil oft nicht das Sammeln weiterer Korrelationen, sondern das genaue Verständnis dessen, was jeder Kreuzpeak aussagt und was nicht.