Elektron-Elektron-Doppelresonanz (DEER) in der DNA-Strukturanalyse – EPR (ESR)-Anwendungen

Seit Watson und Crick in den 1950er Jahren die klassische Doppelhelixstruktur der DNA vorschlugen, steht die DNA im Mittelpunkt der biowissenschaftlichen Forschung. Die Anzahl der vier Basen in der DNA und ihre Anordnungsreihenfolge führen zur Vielfalt der Gene, und ihre räumliche Struktur beeinflusst die Genexpression.

Zusätzlich zur traditionellen DNA-Doppelhelixstruktur haben Studien eine spezielle viersträngige DNA-Struktur in menschlichen Zellen identifiziert, den G-Quadruplex, eine hochrangige Struktur, die durch die Faltung von DNA oder RNA entsteht, die reich an Tandemwiederholungen von Guanin ist (G ), die in sich schnell teilenden Zellen besonders hoch ist. G-Quadruplexe kommen besonders häufig in sich schnell teilenden Zellen (z. B. Krebszellen) vor. Daher können G-Quadruplexe als Wirkstoffziele in der Krebsforschung eingesetzt werden. Die Untersuchung der Struktur des G-Quadruplex und seines Bindungsmodus an Bindemittel ist wichtig für die Diagnose und Behandlung von Krebszellen.

Schematische Darstellung der dreidimensionalen Struktur des G-Quadruplex.
Bildquelle: Wikipedia

Elektron-Elektron-Doppelresonanz (DEER)

Die Pulsed Dipolar EPR (PDEPR)-Methode wurde als zuverlässiges und vielseitiges Werkzeug zur Strukturbestimmung in der Struktur- und chemischen Biologie entwickelt und liefert mithilfe von PDEPR-Techniken Abstandsinformationen im Nanomaßstab. In G-Quadruplex-Strukturstudien kann die DEER-Technik in Kombination mit ortsgerichteter Spinmarkierung (SDSL) G-Quadruplex-Dimere unterschiedlicher Länge unterscheiden und das Bindungsmuster von G-Quadruplex-Bindungsmitteln an das Dimer aufdecken.

Differenzierung von G-Quadruplex-Dimeren unterschiedlicher Länge mithilfe der DEER-Technologie Unter

Verwendung von Cu(pyridin)4 als Spinmarkierung zur Abstandsmessung wurde der tetragonal-planare Cu(pyridin)4-Komplex kovalent an den G-Quadruplex gebunden und der Abstand zwischen zwei paramagnetischen Cu2+ bestimmt im π-gestapelten G-Quaternärmonomer wurde durch Nachweis von Dipol-Dipol-Wechselwirkungen gemessen, um die Dimerbildung zu untersuchen.

[Cu2+@A4] (TTLGGG) und [Cu2+@B4] (TLGGGG) sind zwei Oligonukleotide mit unterschiedlichen Sequenzen, wobei L den Liganden bezeichnet. Die DEER-Ergebnisse von [Cu2+@A4]2 und [Cu2+@B4]2 sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Aus den DEER-Ergebnissen lässt sich ableiten, dass in [Cu2+@A4]2-Dimeren der durchschnittliche Abstand einzelner Cu2+ -Cu2+ beträgt dA=2,55 nm, das G-Quadruplex-3′-Ende bildet durch Schwanz-Schwanz-Stapelung ein G-Quadruplex-Dimer und die gz-Achse von zwei Cu2+-Spinmarkierungen im G-Quadruplex-Dimer ist parallel ausgerichtet.

Der [Cu2+@A4]2 π-Stapelabstand ist im Vergleich zu den [Cu2+@A4]2-Dimeren länger (dB-dA = 0,66 nm). Es wurde bestätigt, dass jedes [Cu2+@B4]-Monomer ein zusätzliches G-Tetramer enthält, ein Ergebnis, das vollständig mit den erwarteten Abständen übereinstimmt. Somit können Abstandsmessungen mit der DEER-Technik G-Quadruplex-Dimere unterschiedlicher Länge unterscheiden.

Abb. 1 (A) Das gepulste EPR-Differenzspektrum (schwarze Linie) des [Cu2+@A4]2-Dimers und seine entsprechende Simulation (rote Linie) (34 GHz, 19 K); (B) Nach der Hintergrundkorrektur vier Phasen in der Ad-DEER-Zeitbereichskarte der Feldposition (schwarze Linie) und das beste Anpassungsergebnis von PeldorFit (rote Linie); (C) Distanzverteilung, erhalten mit PeldorFit (rote Linie) und MD-Simulation (graue Linie); (D) [Cu2+-Gleichgewicht zwischen @A4]-Monomer und [Cu2+@A4]2-Dimer. (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Abb. 2 (A) DEER-Zeitbereichsdiagramme (schwarze Linien) an vier Feldpositionen ad nach [Cu2+@B4]2-Hintergrundkorrektur und den besten Anpassungsergebnissen von PeldorFit (rote Linien); (B) [Cu2+@B4 ]; (C) Distanzverteilung, erhalten mit PeldorFit (rote Linie) und MD-Simulation (graue Linie). (Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Untersuchung des Bindungsmodus des G-Tetramer-Bindungsmittels an Dimer mithilfe der DEER-Technik

Viele kleine Moleküle und Metallkomplexe mit planaren aromatischen konjugierten Systemen und positiven Ladungen können gefaltete Sekundärstrukturen binden und stabilisieren und werden so zu potenziellen Krebsmedikamenten.
N,N'-Bis[2-(1-piperidinyl)ethyl]3,4,9,10-perylenetetracarboxydicarbonylhydrochlorid (PIPER) ist ein bekanntes G-Quadruplex-Bindemittel, das durch Stapeln an den Quadruplex binden und ihn stabilisieren kann. und der Bindungsmodus von PIPER an den G-Quadruplex kann mit der DEER-Technik untersucht werden.

Abbildung 3 und Abbildung 4 zeigen die Ergebnisse von DEER-Experimenten mit unterschiedlichen Verhältnissen von PIPER zu [Cu2+@A4]2-Dimer. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Verhältnis von PIPER zu [Cu2+@A4]2-Dimer von 1:1 (PIPER@[Cu2+@A4]2) dP = 2,82 nm beträgt.
Der größere Abstand zwischen Cu2+-Cu2+ im Vergleich zu den reinen [Cu2+@A4]2-Dimeren (dA = 2,55 nm) weist darauf hin, dass PIPER mit dem Dimer einen Sandwichkomplex bildet, wobei das planare organische Molekül zwischen den 3′-Flächen der beiden G liegt tetramere Monomere. Wenn das Verhältnis von PIPER zu [Cu2+@A4]2-Dimer 2:1 beträgt (2PIPER@[Cu2+@A4]2), beträgt d2P = 3,21 nm.
Ein zusätzlicher π-Stapelabstand im Vergleich zum PIPER@[Cu2+@A4]2-Dimer (dP = 2,82 nm) weist auf die Insertion von zwei PIPER-Liganden in das Schwanz-an-Schwanz-angeordnete G-Tetramer-Dimer hin. Die DEER-Technik kann einen neuen Bindungsmodus der Insertion des G-Tetramer-Bindemittels PIPER in das G-Tetramer-Dimer aufdecken, um interkalierte Komplexe zu bilden.

Abb. 3 (A) DEER-Dipolspektren mit unterschiedlichen Verhältnissen von PIPER und [Cu2+@A4]2-Dimer (geff =2,061); (B) DEER-Modulation mit unterschiedlichen Verhältnissen von PIPER und [Cu2+@A4]2-Dimertiefe; (C) Gleichgewicht von [Cu2+@A4]2-Dimer und PIPER@[Cu2+@A4]2, 2PIPER@[Cu2+@A4]2, PIPER@[Cu2+@A4].
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

Abb. 4 (A) DEER-Zeitbereichsspektrum von PIPER@[Cu2+@A4]2; (B) PIPER@[Cu2+@A4]2-Abstandsverteilung, erhalten durch Verwendung von PeldorFit (rote Linie) und MD-Simulation (graue Linie); (C) DEER-Zeitbereichsspektrum von 2PIPER@[Cu2+@A4]2; (D) 2PIPER@[Cu2+@A4]2-Abstandsverteilung, erhalten mit PeldorFit (rote Linie) und MD-Simulation (graue Linie).
(Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 4939-4947)

CIQTEK Pulse Electron Paramagnetic Resonance Spectrometer

Das CIQTEK-Pulselektronen-Paramagnetresonanzspektrometer EPR100 unterstützt die Doppelelektronenresonanztechnologie und kann zur Untersuchung der strukturellen Lokalisierung, der funktionellen Interpretation, der physiologischen Bewegungsprozesse und der Wirkmechanismusinterpretation komplexer Membranproteine, DNA, RNA und Nukleinsäuren-Protein verwendet werden Komplexe und verwandte Proteinmoleküle, die bei verschiedenen Krankheiten eine Schlüsselrolle spielen.

CIQTEK Pulse Electron Paramagnetic Resonance Spectrometer EPR100


DEER-Experimentergebnisse von CIQTEK EPR100

Experimentelle Ergebnisse nach Verarbeitung mit DeerAnalysis